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m6A-seq RNA甲基化测序

产品简介

m6A是一种常见的RNA甲基化修饰方式,研究表明它在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。开yun体育app官方下载的微量meRIP-seq技术,通过特殊的技术优化,大大降低meRIP-seq对样本量的要求,和常规的meRIP-seq需要上百μg的总RNA量相比,微量meRIP-seq仅仅1μg-20μg总RNA量即可满足实验要求。利用最新的去rRNA技术,可以同时检测mRNA、lncRNA及circRNA的甲基化修饰谱,帮助研究人员对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究。

实验流程

技术优势

1. 样本要求低:500ng~20μg总RNA

2. 同时适用于细胞株和临床样本(包括外泌体样本)

3. 全面覆盖mRNA、LncRNA、circRNA的m6A修饰

测序方案

1. 测序平台:Illumina Nova Seq 6000

2. 测序模式:PE150

3. 测序数据:20G(IP10G+Input10G)

研究思路参考

经典案例




研究目的:通过m6A测序解析m6A在宫颈癌(CC)肿瘤发生中的作用

样本信息:宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织

测序策略:m6A-meRIP-seq

结论:METTL3作为m6A甲基转移酶家族的核心成员,在CC中大幅上调。转录因子ETS1招募P300和WDR5分别介导METTL3启动子中H3K27ac和H3K4me3组蛋白修饰,诱导METTL3转录激活。通过MeRIP-seq确定了TXNDC5为METTL3介导的m6A修饰的靶点,并揭示了METTL3介导的TXNDC5表达依赖于m6A读取器的方式。通过体内外实验验证了METTL3通过调节TXNDC5的表达促进CC细胞增殖和转移。

结果展示

Motif分析

与蛋白质结合的特定碱基序列为motif, 我们利用HOMER(http://homer.ucsd.edu/homer/ngs/peakMotifs.html)软件对Peaks进行motif分析。





GO分析

GO分类能从各方面描述基因的功能,而GO主要可以分为三个主要的类群,生物学进程(Biological Process,BP),分子功能(Molecular Function,MF)和细胞组分(Cellular Component)。




KEGG分析

KEGG分析是基于基因注释数据库。因此,KEGG分析的关键在于拥有完备的数据库和较完整的Pathway注释。 相对于GO分析,KEGG分析更为直接的让研究者可以很好地对于目标基因进行研究。信号通路分析的目的是基于KEGG数据库去寻找m6A基因显著性富集的信号通路。





组间差异分析

通过找不同样本之间或者疾病组(处理组)与对照组之间的差异,得到某种疾病(或处理条件下)差异的m6A修饰水平,从而在m6A水平上解释开yun体育app官方下载转录组在疾病的发生、发展中的作用。分析内容有以下几个方面:


1.差异Peak

2.差异Peak基因的GO分析、KEGG分析。




送样建议

样本量


m6A RNA甲基化修饰测序

RNA

总量≥20μg,浓度≥50ng/μl,纯度OD260/280在1.8-2.2之间,OD260/230≥2,RIN值≥6.5,28s:18s≥1(Qubit检测浓度,不是NanoDrop的浓度检测)

RNA完整无降解,无DNA、蛋白质、多糖等污染(若有2100的质检结果更好)

注意:人、大小鼠

细胞样本

≥5x106个细胞

收获培养的细胞后,离心去除培养液,PBS洗2次,液氮速冻,-80℃保存,干冰运输,务必保证细胞无支原体污染,若有污染会影响最终数据,需要重新制样

组织样本

冻存组织≥20mg,0.2cmx0.2cm组织块,PBS清洗血渍毛发等,吸干,液氮速冻,-80℃保存,干冰运输

血液样本

≥10ml,EDTA抗凝(不能用肝素),-80保存,干冰运输


采样建议

一、细胞样本离心收集细胞,然后用1xPBS漂洗1~2次,彻底去除PBS溶液。注意细胞离心收集速度 要适度,一般样本3,000rpm离心5min即可。不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分 渗透,转数过高还会导致细胞破裂,RNA降解。再用充足量TRIzol对细胞进行裂解,裂解 过程中用移液器轻轻反复吹吸,如发现裂解液有明显粘丝现象,表示裂解不是很充分,可以适当增加裂解液的用量,最终应为裂解液澄清,没有细胞碎片团块。裂解在TRIzol中的样品,需转移至-80°C冰箱。参考用量:1mL TRIzol裂解106细胞,最多107细胞。

细胞量:最低不少于5x106细胞(5x106细胞可以提到到大约20ug总RNA)

细胞样本必须是用充足量TRIzol对细胞进行充分裂解,不能直接收集细胞沉淀寄送,以防RNA降解


二、组织样本标本离体后应在最短时间内(<30 min)更换器具切取。每个样本将组织切成3-4块,每块约0.2 cm3大小组织,装入已加入1ml RNA later(Ambion)的2ml RNAase free离心管中, 每个离心管放3-4块。样品4°C放置过夜,使溶液充分渗入到组织中后,再转移至-80°C。 组织量:20mg,最少不少于10mg(注:10mg组织大约可以提取20ug总RNA)。

必须用RNA later充分处理,以防RNA降解


三、全血样本

RNASafer LS Reagent(http://www.magentec.com.cn/products.php?ID=632,不限于这个厂家,其它厂家也可以);RNASaferTM LS Reagent是专门针对液体样品(血液、唾液、细胞培养液)而设计的RNA保护剂。保护剂中含有阳离子表面活性剂,能快速高效地裂解细胞,并能使RNA形成稳定的电中性复合物,保护RNA不发生降解。血液、唾液、血清、血浆、尿 液、细胞培养液等液体样品和RNASaferTM LS Reagent混合后。可以室温保存三天,在2-8°C保存一个周,或-20/-80°C至少六个月。该方案已经成功运用于细胞培养液,唾液RNA的保护和血液RNA的保护。

a)用合适的容器收集血液、唾液、尿液和细胞培养液等。(血液样本推荐EDTA,禁止使用肝素)

b)立即加入3倍体积RNASafer LS Reagent至样品中。颠倒混匀10-20次,室温静置30分钟

c)该混合液可以室温(15-25°C)保存三天; 2-8°C可以保存一周,-20/-80°C保存至少六个月以上,其RNA不会降解

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