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10x Genomics Visum FFPE

产品简介

空间转录组是指通过一次实验可得到样本的mRNA表达信息,并且可以比对到相应的H&E染色图像,达到图像化和数字化的高度整合分析。空间转录组学分析可展示组织切片中不同区域的基因表达情况,揭示精细病理区域中激活的信号通路, 完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组被广泛用于肿瘤、发育生物学、神经科学等多领域,为肿瘤异质性、肿瘤微环境、复杂疾病的机制解析提供新的见解。


技术原理

空间转录组的核心在于独特的捕获芯片,正式文库构建的芯片上有4个捕获区域(6.5mm X6.5mm,可以加4个样本),每个捕获区域含有约5000个被条形码标记的点(barcoded spots),每个spot直径55μm,spot与spot中心点之间的距离为100μm,每个spot含有上百万个可以与mRNA结合的捕获探针,每个探针上都带有独特的spatial barcodes,用以标记捕获的mRNA的空间位置。





针对FFPE样本的特殊性,10x Visium目前针对小鼠(1.8万个基因)和人(2万个基因)的基因数据库设计了探针,每一个基因(人和小鼠),都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列,LHS(左端探针)带有read2序列,用以后续PCR扩增,RHS(右端探针)带有polyA序列,用以后续被玻片上的探针捕获结合,通过probe与组织内RNA杂交,将RNA信息转移到probe上,再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链,然后透化释放连接的probe,完成信息捕获过程(FFPE样本不需要针对不同类型的样本摸索透化条件,所有的样本类型都用同样的透化条件)。


捕获的probe在玻片上进行延伸反应,生成cDNA,回收单链cDNA并构建测序文库进行上机测序,从而获取基因表达信息。载玻片上的每个捕获区域都有一个oligo阵列,每条oligo上包含与probe结合的捕获探针,该oligo同时具备描述空间信息的标记性序列。


基于探针设计捕获方式,FFPE样本文库构建大小在240bp左右,不同于冰冻组织450-470bp;测序深度在25k reads pair/per spot左右即可满足分析需要,不同于冰冻组织50k reads pair/per spot的要求。




FFPE样本探针杂交链接

产品特色

1. 样本收集灵活:石蜡包埋样本,可以长期储存;

2. 分辨率高:每个捕获区域有5000个mRNA捕获点;

3. 时效性高:实现远程全息数字切片扫描实时交流;

4. 样本兼容范围:人和小鼠组织都可以建库;

5. 专业的组织透化方案:FFPE样本不需要进行透化预实验的摸索,透化条件统一;

6. 结果可验证性强:当前常用的实验手段,比如免疫荧光等可轻松验证实验结果。

经典案例








研究目的:使用空间转录组学检测肾细胞癌(RCC)中肿瘤三级淋巴器官(TLS)内B细胞反应的性质

样本信息:24个ccRCC原发性肿瘤(冷冻样本(n=12)&FFPE切片(n=12))

测序策略:10xGenomics平台,单细胞空间转录组(ST)+Bulk RNAseq

捕获细胞数:NA

结论:B细胞在TLS中富集,在TLS中可以识别B细胞成熟到浆细胞(PC)形成的所有阶段。B细胞组库分析显示TLS的克隆多样化、选择、扩增和远端完全成熟克隆型的存在。在TLS+肿瘤中,产生IgG和IgA的PC沿着成纤维细胞轨道扩散到肿瘤床中。TLS+肿瘤表现出高频率产生IgG的浆细胞以及IgG染色、凋亡的恶性细胞,提示其抗肿瘤活性。免疫检查点抑制剂治疗的RCC患者的治疗反应和无进展生存率与IgG染色的肿瘤细胞相关。


结果展示

质量控制

这里通过Number of Genes,Total Counts,Percentage of Mitochondrial Counts对每个样本的质控指标进行统计,由于空间转录组的特殊性(重点关注切片染色基因的表达分布),不对spot点进行过滤。





Spot分群

Spot分群是依据基因表达量对spot进行分类的过程,spot分群是后续各种研究的基础。






标志基因发现和富集分析

标志基因发现是指通过差异分析计算特定群高表达基因的过程。





富集分析是寻找上述高表达基因富集的通路的过程。



特征评分

特征评分是指基于特定基因集计算该基因集在不同群的表达情况。





送样建议

1. 石蜡包埋的FFPE样本包埋后低温保存(4℃或者-20℃),4℃冰袋运输

2. 样本处理和运输过程需要在低温环境,FFPE样本冰袋运输

3. 如果样本充足,建议准备≥2份样本,一份用于RNA质控和正式切片实验,一份留作备用


开yun体育app官方下载承接过的部分空转样本

样本类型 样本类型
胰腺癌样本(正常胰腺不成功,酶多,RNA降解) 皮肤组织(糖尿病慢创建模小鼠/黑色素瘤)
乳腺癌样本 脊髓样本
脑胶质瘤样本 炎症性肠病/克罗恩肠病(肠纤维化)
肝癌样本 血管样本(血管畸形/糖尿病截止病人血管)
肺癌样本 舌下腺
胃癌样本 前列腺增生组织
胆囊癌样本/胆管组织 小鼠胚胎头部/腭部
小鼠正常肝脏(肝再生) 小鼠正常心脏(心脏发育)

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