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非靶代谢组学

产品简介

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后出现的新兴“组学”,是转录组学和蛋白质组学的延伸,能够更直接、更准确地反映生物体的生理状态,是系统生物学的重要组成部分。系统生物学中,基因组学告诉你可能发生什么,蛋白组学告诉你正在发生什么,而代谢组学是最接近表型的组学,告诉你已经发生了什么。

非靶代谢组学(Untargeted metabolomics)是指对生物样本中的所有小分子化合物(分子量小于1000)进行定性和定量分析,并比较不同样本间代谢物差异、筛选出在不同组间具有重要生物学意义的显著差异代谢物的技术。



应用方向

广泛应用于精准医学、营养代谢、微生物代谢等研究方向。


项目流程

代谢组学实验流程分为样本准备、代谢物提取、色谱分离、质谱检测以及数据分析。



LC-MS/MS技术特点

相比NMR和GC-MS平台,LC-MS/MS在临床科研中应用更广泛,具有高分辨率、高灵敏度、前处理简单以及分析物质种类更广谱等特点。




开yun体育app官方下载优势

1.丰富的样本处理经验,支持各类科研需求;

2.严格的质量标准,优秀的技术检测能力,高质量的30万+谱图数据库;

3.追求极致的报告体验,提供筛选标准结果,报告解读、数据挖掘视频及中英文方法说明等应有尽有,详情点结果示例;

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结果展示

非靶代谢分析流程如图所示,涉及数据库搜库、多元统计分析、层次聚类分析、相关性分析、ROC分析和KEGG代谢通路等功能分析。






★项目具体分析内容以实际交付报告为准。


(1)数据质控

数据质量控制(Quality Control,QC)是获得稳定性和准确性的代谢组结果的必要步骤。尤其是当样本量大的时候,样品上机检测需要一定的时间,代谢物检测过程中仪器的稳定性、信号响应强度是否正常就显得尤为重要。质控能够及时发现异常,尽早解决问题,以保证最终采集数据的质量。





QC样本相关性分析(左)&PCA分析(右)



(2)多元变量统计分析

由于代谢组数据具有高维度且变量间高度相关的特点,运用传统的单变量分析无法快速准确地挖掘数据内潜在的信息。因此在代谢组数据分析需要运用多元统计的方法,如PCA、OPLS-DA/PLS-DA分析,在最大程度保留原始信息的基础上对采集的多维数据进行降维和回归分析,然后进行差异代谢物的筛选及后续分析。




PCA分析(左)&OPLS-DA/PLS-DA分析(右)



(3)差异代谢物筛选结果统计

差异代谢物的筛选主要参考VIP、FC和P-value三个参数,通常筛选条件为VIP>1,P-value≤0.05,可根据实际项目鉴定情况对此筛选标准进行调整。




(4)火山图

火山图可直观显示差异代谢物的整体分布情况。





(5)火柴杆图

根据每组差异比较组合得到的差异代谢物绘制火柴杆图,能够较为清晰的表示代谢物的上下调以及差异倍数变化较大的物质。




(6)  Z-score图

Z-score(标准分数)是基于代谢物的相对含量转换而来的值,用于衡量同一水平面上代谢物的相对含量的高低。





(7)箱线图

箱线图可以将中央趋势的衡量统计量与分散度的衡量统计量利用图形表现出来,在评估数据的对称性、识别数据异常值和数据的数值比较上起着重要作用,将各组比较得到的差异代谢物进行箱线图绘制,可以看到差异代谢物在不同的实验组中的变化和差异情况。



(8)Venn分析

通过多个比较组合的差异代谢物进行Venn图展示,可以直观比较不同组之间共有(overlap)及特有(unique)差异代谢物,展示多组差异代谢物之间的关系。







(9)  层次聚类分析图

聚类分析用于判断不同实验条件下代谢物的代谢模式。代谢模式相似的代谢物可能具有相似的功能,或是共同参与同一代谢过程或者细胞通路。因此通过将代谢模式相同或者相近的代谢物聚成类,可以推测某些代谢物的功能。




(10)  相关性分析图

代谢物两两之间变化趋势的一致性,红色表示正相关,蓝色表示负相关。



(11)和弦图

和弦图是一种展示数据间相关性的可视化方法,节点数据沿圆周径向排列,节点之间使用有宽度的弦连接。基于差异代谢物的相关系数绘制和弦图,可反映样本中差异代谢物之间的相关性和关联程度。



(12)代谢通路富集结果

KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。富集结果以KEGG Pathway为单位,应用超几何检验,找出与所有鉴定到代谢物背景相比,在差异代谢物中富集的Pathway。通过Pathway富集能确定差异代谢物参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。





(13)  ROC曲线图

ROC曲线(Receiver operating characteristic)又叫受试者工作特征曲线或感受性曲线, 是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈),以真阳性率(灵敏度)为纵坐标,假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。获得的差异代谢物用ROC曲线来评判潜在的生物标记物。





文献案例



期刊: Journal of Proteome Research

影响因子:5.370

发表单位:广州市妇女儿童医疗中心

发表时间: 2022年1月


一、研究背景

脑性瘫痪是一组以运动和姿势障碍为特征的静态、非进行性脑损害,是儿童最常见的肢体残疾。现有证据表明,肉毒杆菌神经毒素A(BoNT-A)可以通过抑制受影响肌肉的神经肌肉连接中乙酰胆碱的释放,安全而有选择性地减少痉挛,但代谢物的动态变化如何影响作用时间尚不清楚。


二、研究结果

1. 受试者的临床基线特征

共有91名儿童参与本研究,其中22名儿童在多个采样时间点提供血浆样本,共计120例血浆样本。各时间点的受试者临床特征如图所示。在BoNT-A注射前,GMFCS I级、II级和III级的比例分别为46.67%、20%和26.67%。注射1个月后,GMFCS I-II型患儿的比例显著增加至56.67%和26.67%,而GMFCS III型患儿的比例显著降低至13.33%。在注射BoNT-A后,粗大运动功能评定得分在不同时间点有不同程度的提高。采用改良Ashworth量表和改良Tardieu量表测量肌肉痉挛,TP2组和TP3组均明显降低,TP1组和TP4组无显着差异。




2. 血浆样本的整体代谢组学分析

为了确保分析方法的稳健性,我们通过对所有样本进行主成分分析,对数据进行了全局检查,结果表明不同组别间区分明显。







3. BoNT-A对血浆代谢改变的影响

为了确定BoNT-A注射如何改变痉挛性CP儿童的代谢组,对所有采样时间点的代谢组进行差异分析。本研究共鉴定了354种代谢物,其中195种在METLIN数据库中有暂定的ID。39种具有ID的代谢物存在显著变化。利用雷达图以显示不同采样时间点变化显著的代谢物。结果表明,注射BoNT-A 1个月后,核糖、酪氨酸、琥珀酸和羟基脲水平显著升高。丙酮酸和葡萄糖在注射3个月后下降最明显。然而,苯丙氨酸在这一时期显著上调。此外,核糖、葡萄糖酸内酯、丙酮酸和延胡索酸在注射6个月后起主要作用。





差异的代谢物在组间的变化情况,如表所示。进一步的分析表明,性别差异对大多数代谢物水平的影响不显著。





4. 血浆代谢谱的相关性分析

代谢物相关性分析结果以热图展示。结果表明,代谢物间主要呈正相关。此外,亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸在TP1和TP2之间具有很强的相关性(r= 0.70 ~ 0.95,p<0.05)。在TP1和TP3之间,棕榈酸与硬脂酸、反油酸和亚油酸(r= 0.84 ~ 0.89,p<0.05)、十四烷与反油酸、亚油酸和顺式二十碳-11-烯酸(r= 0.73 ~ 0.80,p<0.05)以及塔格糖与β-丙氨酸(r= 0.80,p<0.05)呈强正相关。在TP1和TP4之间,尿嘧啶与葡萄糖、塔格糖、β-丙氨酸和葡萄糖酸内酯(r= 0.75 ~ 0.93,p<0.05),塔格糖与丙酮酸和β-丙氨酸(r=0.70和0.80,p<0.05), 葡萄糖酸内酯与β-丙氨酸(r=0.83,p<0.05)呈显著正相关。







5. 代谢途径与功能分析

代谢途径富集分析发现,TP1与其他组之间存在不同的代谢途径,包括TCA循环和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢等。14条代谢途径在TP1和TP2之间有显著性差异,如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,TCA循环,泛酸盐和辅酶a生物合成, β丙氨酸代谢。注射BoNT-A 6个月后,β-丙氨酸代谢、丁酸代谢、TCA循环、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢起重要作用。







6. 网络分析

在TP1和TP2之间,22个不同丰度的代谢物分布的整个网络中,包括7个不同的途径和84个反应,两个独立的代谢物簇。同样,TP1和TP3、TP1和TP4之间的代谢物或代谢途径则大致聚集在一起。研究结果表明,功能代谢物簇在注射BoNT-A后有序改变,各簇内的代谢物表现出相关性。


三、研究总结

本研究不同时间点共鉴定出354种代谢物,其中39种为显著性差异的代谢物(p<0.05, VIP > 1)。通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)揭示了不同时间点之间的明显区别,网络分析显示了功能代谢物的协同变化。总的来说,我们的研究结果发现,CP患儿注射BoNT-A后,血浆代谢产物发生了显著的动态变化。与能量消耗相关的代谢途径可能为研究BoNT-A的作用提供新的视角,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢和半胱氨酸、蛋氨酸代谢可能与BoNT-A的作用时间有关。





开yun体育app官方下载助力

该研究中的非靶代谢组由开yun体育app官方下载提供。

送样建议

1.样本寄送流程



注意:所有样本均应标明准确的样本编号,同时配有一张样本登记表,写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。


2.样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。


3.取样原则

(1)代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义,因此您应该根据实验目的慎重选择取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织,正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时,应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。

(2)准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录,并按要求(低温、迅速)采集、制备、贮存、运输,最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

(3)迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素,因此用于蛋白质组研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

(4)低温原则

所取样本离体后,应尽快置于液氮(首选)、干冰或-80℃冰箱中,并保证在实验前始终处于-70℃以下,以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

(5)分装原则

为避免样本冻融,建议收集样本的时候对样本进行分装备份,从而保证数据质量的可靠性,检测结果的准确性。


4.取样要求

(1)样本量要求


样品类型

非靶代谢送样量

组织类

心,肝,脾,肾,肺叶,血管,皮肤等

常规:200mg及以上

风险:50mg及以上

体液类

血清/血浆

常规:0.3ml及以上

风险:0.1ml及以上

尿液

脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液、胆汁等

细胞类

悬浮细胞/贴壁细胞

常规:1×107以上

风险:5×106以上

粪便类

粪便/内容物

常规:200mg及以上

风险:50mg及以上


(2) 本地样本预处理与保存建议

样品类型

预处理及保存

组织类

心,肝,脾,肾,肺叶,血管,皮肤等

PBS洗涤去除残留血液和污染物,冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织剪切成1cm3左右的小块,样品称重,等量分装。液氮速冻,-80°C 保存。

体液类

血清

收集好的全血室温静置两小时,3000g 离心10min,取上清,液氮速冻,-80℃保存

血浆

收集好的全血加入抗凝剂,室温静止30 分钟,1300g-2000g 离心10min,取上清,液氮速冻,-80℃保存

尿液

5000×g 4°C 离心30-60min,取上清, -80℃保存

脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液、胆汁等

4℃ 1000g-2000g 离心10min,(或使用0.22μm 滤膜过滤),取上清,-80℃保存

细胞类

悬浮细胞

保证每份样本细胞数一致!如果细胞数不一致,可考虑BCA定量校正(收费,风险实验)

1. 400g-1000g离心3分钟收获细胞,弃上清。

2. 用预冷的PBS小心洗涤沉淀物2次,离心,去上清,收集在1.5ml离心管中。

3. 液氮速冻,-80℃保存。

除需要检测的样品之外,每组样品需要另外提供1-2 份重复样品用于质控样品(QC)的制备。

贴壁细胞

保证每份样本细胞数一致!如果细胞数不一致,可考虑BCA定量校正(收费,风险实验)

1. 弃掉培养液,并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液

2. 加入4℃预冷的PBS,平放轻轻摇动1 分钟洗涤细胞,然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液。

3. 将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4℃预冷的PBS。用干净的细胞刮棒,将细胞刮于培养皿的一侧,动作要快(也可胰酶消化),冰上斜置培养皿,使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清。

4. 液氮速冻,-80℃保存。

除需要检测的样品之外,每组样品需要另外提供1-2 份重复样品用于质控样品(QC)的制备。

粪便类

粪便

人:采集前先排尿。将粪便排于清洁干燥的粪便容器中。收集整个粪便,采用无菌小勺、手术刀或粪便取样器等工具,将全部粪便混合均匀,然后分装为多份。每管标记好的2ml进口无菌离心管装量1ml左右的体积,称重记录,采集足量达到样本量要求。每例样本准备多管备份。液氮速冻后-80°C保存。

大鼠或小鼠:置于代谢笼中饲养,一笼一只。采用逼迫法或者按摩腹部法,大鼠或小鼠应激排便,直接将粪便样本采集在无菌管中。同一只鼠收集的样本混合均匀后分装到2ml进口无菌离心管。每管装量1ml左右的体积,称重记录,采集足量达到样本量要求。每个样本取多管备份。液氮速冻后-80°C保存。

内容物

处死实验对象后,用无菌解剖刀在无菌手术台上剖开腹腔,取出整个肠道切取所需肠段的内容物,用无菌手术刀刮取内容物,混合均匀。每管标记好的2ml进口无菌离心管装量1ml左右的体积,称重记录,采集足量达到样本量要求,每个样本取多管备份。液氮速冻后-80°C保存。


5.样本包装注意事项

(1)在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面,用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触;

(2)请勿用纱布、纸张直接包裹样本,而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中;

(3)请勿用玻璃容器在液氮中保存样本;样本包装中请勿使用透明胶带;

(4)请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内,因为纸张在液氮中是易碎的;

(5)标签纸应该贴于样本袋绳上,请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱;

(6)请勿在一只样本袋中放过多的样本,以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷;

(7)在填写《样本登记单》时应当详细描述(临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段)样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节,以便技术人员确定合理的实验方案。


6.样本储存注意事项

(1)细胞样本收集好后,立即放入-80℃保存;

(2)组织样本采集后,样本迅速放入进口高质量冻存管中,拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存;

(3)组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本,务必注意,请勿用Eppendorf管和国产冻存管,因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。


7.样本运输注意事项

(1)飞机运输干冰上限约为2公斤,超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制;

(2)干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱,材料用编号后的冻存管存放,用塑料袋包装后埋入干冰中,泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装,以免碰裂。并标明轻取轻放提示,以保证安全运输;

(3)运输时可在干冰上再放一排液体冰袋;

(4)如委托快递运输,运输过程中应随时跟踪货物的情况,记录货单号,并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。

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