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TMT 磷酸化蛋白质组学

产品简介

蛋白翻译后修饰(Post-Translational Modification,PTM)赋予了单个蛋白质功能多样性的特性。在众多翻译后修饰中,磷酸化(Phosphorylation)修饰是最常见、最重要也是最被广泛研究的蛋白质修饰。蛋白质的磷酸化由蛋白激酶(Protein Kinase)催化,将ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质的特定氨基酸位点上(主要是丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和酪氨酸Tyr)。

磷酸化修饰是可逆的,去磷酸化由蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase)催化。蛋白质磷酸化状态影响蛋白功能的激活或抑制,磷酸化修饰调节参与细胞内几乎所有的生物学过程,在调控细胞增殖、分化、发育、凋亡中发挥重要作用。生理活动以及疾病发生发展过程中都伴随着磷酸化的调控。因此,研究蛋白质的磷酸化修饰状态对生理病理研究中有着重要意义。

TMT磷酸化蛋白质组学采用Thermo Scientific(赛默飞)公司的TMT (Tandem Mass Tag)标记定量技术,通过对不同样本富集到的磷酸化肽段标记上不同的TMT标签,最终通过标签的不同实现对混合样本的区分以及定量。



应用方向

适用于小规模样本的磷酸化蛋白质组学特征分析、信号通路/调控通路研究、疾病作用机制、激酶或磷酸化底物发现等研究。

项目流程

TMT磷酸化蛋白质组学项目流程包括样本准备、实验室样本制备(含蛋白质抽提、酶解成肽段、磷酸化肽段特异性富集、TMT标签标记、各样本肽段混合、混合肽段分级)、上机检测(各分级肽段分别上机)、数据预处理、生信挖掘等5大环节。


技术特点

1. 全面性:以整个细胞所有磷酸化蛋白为研究对象,研究细胞内所有发生磷酸化修饰的功能蛋白;

2. 高效性:磷酸化肽段富集效率高达95%以上、位点鉴定覆盖率高;

3. 定量准确,高可重复性:不同样本的肽段经标记后等量混合,统一分级并上机检测,避免了非标记蛋白质组学单独样本上机可能带来的误差,显著提高定量准确性和重复性。

开yun体育app官方下载优势

1.丰富的样本处理经验,支持各类科研需求

2.严格的质量标准,优秀的技术检测能力,达到国际顶尖期刊报道水平

项目 来源 样本数量 同样FDR标准下的总检出情况
TMT蛋白质组学+
磷酸化蛋白质组学
文献:Chen et al., 2020,Cell 182,226-244肺癌研究 206个组织样本 10000+个蛋白

20000+个磷酸化位点

TMT蛋白质组学+
磷酸化蛋白质组学
开yun体育app官方下载客户项目 120个组织样本 11756个蛋白

23740磷酸化位点


3.追求极致的报告体验,提供三套差异筛选标准结果,报告解读、数据挖掘视频及中英文方法说明等,详情点结果示例


4.专业的售前售后服务,及时响应客户消息,全力解决客户问题


结果展示

开yun体育app官方下载一直致力于提供专业的蛋白质组学服务,基于蛋白质组学数据挖掘需求以及对高水平文章的生信分析内容的分析,开yun体育app官方下载蛋白质组学报告提供20多项标准分析,远超行业常规交付标准,助力广大科研用户数据挖掘轻松又高效!


详情可点击往期报道:

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1.  多种样本平行性及质量评价维度:从源头上把控数据质量,以提高分析结论的可靠性、可重复性



2. 三套差异筛选标准:让每套数据找到最适合的标准


3套差异筛选结果一览表(示例)

group

P≤0.05 & FC上下调倍数

上调磷酸化位点个数(UP)

下调磷酸化位点个数(DOWN)

总差异磷酸化位点个数(ALL)

A VS B

1.2

734

689

1423

A VS B

1.5

445

394

839

A VS B

2

178

153

331


3. 提供关键磷酸化蛋白质候选列表:让临床科研更轻松、高效


关键磷酸化蛋白质候选列表(表头示例)

modify_id Phospho (STY)

Probabilities

Protein IDs Gene Name FC
差异表达磷酸化信息,

以蛋白质_id_site展示

差异表达磷酸化位点及

其归属肽段

差异表达磷酸化位点归属

蛋白质Uniprot ID号

基因名称 差异变化倍数
p-value regulation GO-BP GO-MF GO-CC
差异显著性 上调或下调 列出磷酸化位点归属蛋

白质显著性富集的GO-

BP条目名称和数量

列出磷酸化位点归属蛋

白质显著性富集的GO-

MF条目名称和数量

列出磷酸化位点归属蛋

白质显著性富集的GO-

CC条目名称和数量

KEGG ppi_degree Transcription factor Kinase Cancer pathway

related

列出磷酸化位点归属蛋

白质显著性富集的KEGG

条目名称和数量

是否属于转录因子 是否属于激酶 是否属于肿痛通路

相关蛋白

Cancer disease

related

pubmed_paper_nums
是否属于肿瘤疾病功能

相关蛋白

在Pubmed中检索到的

文献数


4.  多种GO/KEGG富集分析结果呈现方式






5.  交互式蛋白质互作PPI:支持个性化排版,悬浮显示蛋白质的多项特征信息




6. 磷酸化保守基序(motif)分析:挖掘磷酸化位点共性,为上游激酶预测和磷酸化机制研究提供支持


motif logo图


7. 蛋白质动态分布范围图:展示蛋白含量高低,高低丰度一清二楚



蛋白质动态分布范围图



8. 多组比较提供韦恩分析:展示多比较组的共有和特有差异蛋白质



Venn图


文献案例

期刊: Circulation

影响因子:39.918

发表单位:南京医科大学附属第一医院

发表时间: 2020年2月


一、研究背景

缺血性心脏病(Ischemic heart disease, IHD)是全球发病率最高的疾病之一,心肌梗死(Myocardial infarction, MI)是IHD最严重的表现形式。近年来,研究发现新生鼠心脏具有强大的再生能力,心脏梗死损伤后通过心肌细胞再生使心脏完全恢复正常,而成年人心脏中心肌细胞也保持着极其微弱的再生能力。因此,探索心肌细胞再生机制对于缺血性心脏病的治疗具有深远的意义。

二、研究结果

1. 构建新生小鼠心梗损伤模型,检测心肌再生情况

首先作者构建了新生小鼠心梗损伤诱导心肌再生模型,对出生1天的小鼠进行LAD结扎手术,检测表明手术建模成功,新生鼠心脏在术后1个月恢复正常水平。






2. TMT蛋白质组学+TMT磷酸化蛋白质组学检测心梗损伤修复中的蛋白质和磷酸化修饰变化

模型建立后,作者分别对实验组小鼠损伤心脏梗死周边区组织(n=8)和对照组类似区域的心脏组织(n=8)进行了TMT蛋白质组学和TMT磷酸化蛋白质组学检测。蛋白质组学共发现91个差异蛋白质,其中62个上调,29个下调。磷酸化蛋白质组学分析得到1763个差异磷酸化位点,其中542个磷酸化位点上调(30%),1221个磷酸化位点下调。上调磷酸化位点所属蛋白高度富集在mTOR信号通路,但下调磷酸化位点所属蛋白未见富集显著的通路。





3. 上游激酶预测发现重要的调控激酶CHK1

作者对上调的磷酸化位点进行上游激酶预测分析,发现11个蛋白激酶在心肌再生过程中活性明显增高。鉴于这其中CHK1激酶未在心肌损伤相关研究中被报道过,作者锁定CHK1进行后续研究。WB验证发现CHK1激酶在新生小鼠心肌再生时间窗内高表达,提示其在心肌再生中扮演重要角色。



4. CHK1激酶的功能研究

体外实验上,作者在原代培养的乳小鼠心肌细胞中过表达或敲低CHK1并检测细胞增殖情况,结果表明CHK1过表达促进原代乳小鼠心肌细胞增殖。体内实验,在新生小鼠心梗损伤区域过表达CHK1,新生小鼠心肌再生时间窗延长;敲低CHK1后,新生小鼠心肌细胞再生能力受损。在成年小鼠心脏中过表达CHK1后心肌细胞损伤后再生修复能力增强。以上结果表明,CHK1是新生鼠心肌损伤再生修复的关键激酶。


5. CHK1作用机制研究

已报道的研究表明CHK1参与细胞周期进程与修复的通路主要有DNA损伤修复经典通路、磷酸化组蛋白H3通路、磷酸化E2Fs通路,然而在乳鼠原代心肌细胞过表达CHK1后并未检测到以上通路的变化,这就提示CHK1通过一种新的通路在心肌细胞再生中发挥作用。这时作者想到了磷酸化蛋白质组学分析结果中提示心肌再生过程中mTORC1通路被高度富集,于是进一步探究CHK1与mTORC1通路的关系。在成年小鼠心脏过表达CHK1后给予心梗损伤处理,结果发现过表达CHK1小鼠mTORC1/P70S6K信号通路激活增加且增殖相关基因翻译水平增加,表明CHK1过表达可通过激活mTORC1/P70S6K通路促进成年小鼠心梗后心肌再生,改善梗死后心功能。




三、研究总结

1. CHK1激酶是新生小鼠心肌损伤后再生修复的关键激酶;

2. CHK1激酶过表达可通过激活mTORC1/P70S6K通路促进成年小鼠心梗后心肌再生,改善更死后心功能。


送样建议

1.样本寄送流程





注意:所有样本均应标明准确的样本编号,同时配有一张样本登记表,写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。


2.样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。


3.取样原则

(1)代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义,因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织,正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时,应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。

(2)准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录,并按要求(低温、迅速)采集、制备、贮存、运输,最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

(3)迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素,因此用于蛋白质组研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

(4)低温原则

所取样本离体后,应尽快置于液氮(首选)、干冰或-80℃冰箱中,并保证在实验前始终处于-70℃以下,以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

(5)分装原则

为避免样本冻融,建议收集样本的时候对样本进行分装备份,从而保证数据质量的可靠性,检测结果的准确性。


4.取样要求

(1)样本量要求

样本大类

样本类型

TMT磷酸化送样量

细胞类

悬浮/贴壁细胞

≥1×10^7

动物

组织

心,肝,脾,肾,肺叶,血管等

≥60mg

皮肤,软骨,毛发等坚硬组织

≥400mg


(2)本地样本预处理与保存建议

样本大类

样品类型

预处理及保存

细胞类

悬浮细胞

1. 400g-1000g离心10分钟收获细胞,弃上清;

2. 用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次,置于冰上,去上清;

3. 液氮速冻,-80℃保存。

建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解,裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题,我们需要进一步进行蛋白沉淀,这个过程可能会有一点蛋白的损失。

注意:PBS清洗时需要小心,避免细胞的损失!

贴壁细胞

1. 弃掉培养液,并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液;

2. 加入4℃预冷的PBS,平放轻轻摇动1 分钟洗涤细胞,然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液;

3. 将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4℃预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧(动作要快),冰上斜置培养皿,使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清;

4. 液氮速冻,-80℃保存。

建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解,裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题,我们需要进一步进行蛋白沉淀,这个过程可能会有一点蛋白的损失。

注意:PBS清洗时需要小心,避免细胞的损失!

动物组织

样本

心,肝,脾,肾,肺叶,血管,皮肤等

1.首先准备好用于包装样本冷冻保存管,并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号;

2.准确切除所需组织后,立即剔除非研究所需的组织,并将组织分割成小块;

3.用镊子夹住样本,放入液氮中冷却样本;

4.放入准备好的冷冻保存管中,迅速投入液氮冷却,然后转入-80℃冰箱中保存;

5.填写样本登记单,写明临床病因及所处阶段,样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

软骨等坚硬组织

PBS 洗涤,用手术刀将软骨切成0.5cm3 左右的小块。液氮速冻,保存在-80℃。

毛发等坚韧组织

用适量2%SDS,50mM 磷酸钠(pH7.8)缓冲液漂洗样品,去除污染物,干燥,保存在-80℃。


5.样本包装注意事项

(1)在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面,用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。

(2)请勿用纱布、纸张直接包裹样本,而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

(3)请勿用玻璃容器在液氮中保存样本;样本包装中请勿使用透明胶带。

(4)请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内,因为纸张在液氮中是易碎的。

(5)标签纸应该贴于样本袋绳上,请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

(6)请勿在一只样本袋中放过多的样本,以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。

(7)在填写《样本登记单》时应当详细描述(临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段)样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节,以便技术人员确定合理的实验方案。


6.样本储存注意事项

(1)细胞样本收集好后,立即放入-80℃保存。

(2)组织样本采集后,样本迅速放入进口高质量冻存管中,拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。

(3)组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本,务必注意,不要用Eppendorf管和国产冻存管,因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。

7.样本运输注意事项

(1)飞机运输干冰上限约为2公斤,超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

(2)干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱,材料用编号后的冻存管存放,用塑料袋包装后埋入干冰中,泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装,以免碰裂。并标明轻取轻放提示,以保证安全运输。

(3)运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。

(4)如委托快递运输,运输过程中应随时跟踪货物的情况,记录货单号,并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。



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