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4D-PRM靶向蛋白质组学

产品简介

Parallel Reaction Monitoring(PRM,平行反应监测技术)是一种针对目标蛋白质进行定量检测的靶向质谱技术。由于PRM技术不依赖于抗体,且能在单次检测中实现几十种甚至上百种蛋白质的定量,因此,PRM是目前进行大规模样本或者大数量蛋白质验证的优先推荐技术。

4D-PRM在普通PRM的基础上,利用离子淌度新一维的分离,提高了离子的选择性和灵敏度,并结合了布鲁克timsTOF Pro系列质谱仪PASEF的扫描速度优势,从而增加了单次可监测的靶标离子的数量。凭借PASEF技术的速度和额外的TIMS根据离子淌度进行分离的优势,4D-PRM在不牺牲检测灵敏度、扫描速度及选择性且单次靶向离子数最大化的前提下,可实现更多、更快、更准确的靶向蛋白质组检测,带领靶向蛋白质组学突破研究瓶颈进入新高度。


应用方向

适用于蛋白质表达变化验证、疾病生物标志物开发等

项目流程

4D-PRM项目流程包括样本准备、实验室样本制备、上机检测(含4D-PRM预实验和4D-PRM正式实验)、数据分析等4大环节。



技术特点

1. 4D-PRM预实验评估成功率高达90%,绝大多数前蛋白质组学的差异蛋白质均可通过4D-PRM进行验证

项目 样本类型 技术路线 4D-PRM方法建立成功率
1 人细胞 4D label free 91%
2 人细胞 5D label free 72%
3 小鼠视网膜组织 4D label free 92%
4 小鼠视网膜组织 5D label free 78%
5 大鼠脑脊液 480 label free 85%
6 小鼠脑组织 480 label free 90%
7 小鼠细胞 4D label free 90%


补充说明:目前无5D-PRM技术。因5D label free蛋白质组学技术检测到的蛋白质比4D蛋白质组学多,所以4D-PRM技术对5D结果验证时,方法建立成功率相比4D蛋白质组学有所下降,此为正常现象。


2. 更快的采集速度,一次实验可验证多达100种蛋白质:得益于timsTOF Pro大于120Hz的MS/MS扫描速度,相比传统PRM一次只能验证30种蛋白质,在相同分析时长下4D-PRM能以更快的扫描速度实现更多差异蛋白质更高通量的验证。



3. 更高的离子选择性,定量更准确:在timsTOF Pro上,4D-PRM因为有离子淌度的分离,具有更强的选择性。离子过滤窗口(Ion Mobility Filter)处于关闭状态时,相同质荷比的离子不能有效区分,离子选择性弱。谱图存在明显的杂峰,定量准确性较低;相比之下,离子过滤窗口打开后,离子淌度能有效区分相同质荷比但形状和截面不同的离子,显著降低目标离子的背景,产生更强的离子选择性和更高的定量准确性。



产品选择建议

PRM技术存在不同技术路线,每种技术有其技术优势,可根据前组学技术路线、验证的差异蛋白数量以及对数据质量的要求进行综合选择。各类技术特点如下。

PRM 30 4D-PRM 30 4D-PRM 100
验证蛋白数 30个蛋白 30个蛋白 100个蛋白
目标蛋白的选择 如果有关注的目标蛋白可在PRM预实验前提供;如果没有,可基于PRM预实验结果再进行挑选
PRM实验所用仪器 Orbitrap等系列质谱仪 timsTOF Pro系列
前组学项目类型要求 可衔接3D Label free/TMT/DIA合同 无限制,

如3D Label free/4D Label free/5D label free/TMT/DIA/4D-DIA

均可衔接

准确性 比DDA蛋白质组学实验

(如label free或TMT等)准确度高


准确性更高,重复性好,定量偏差小
实验质控 使用商业化的iRT标准肽段作为内标,进行保留时间的校正;

iRT内标肽为合成肽段,非天然存在的肽段,添加到样本中不会对结果产生影响

实验流程 建库预实验 必须,基于1例混样进行PRM预实验,评估哪些蛋白可以进入后续正式实验
正式实验 根据预实验,可以选择做或者不做正式实验
周期 预实验:15个工作日;正式实验:15个工作日
备注 前组学结束-PRM预实验启动:3个月以内;超过3个月,蛋白溶液可能降解,影响预实验效果;
PRM预实验反馈-PRM正式实验启动:最好2周内反馈,

最迟不超过1个月;超过1个月,可选择重新建库,或选择风险实验做;

一般1月内会清洗1次仪器,色谱柱1~2个月会更换,仪器状态会发生变化;

重新预实验,需再收一次预实验费用

PRM/4D-PRM无需依赖抗体,拟验证的差异蛋白数量少时,可直接选择免疫检测法(WB/ELISA)

开yun体育app官方下载优势

1. 丰富的样本处理经验,支持各类科研需求;

2. 严格的质量标准,优秀的技术检测能力;

3. 专业的售前售后服务,及时响应客户消息,全力解决客户问题。

结果展示

1. 目标蛋白质肽段列表

该表展示4D-PRM正式实验中目标蛋白质鉴定到的肽段、肽段电荷数、质荷比及保留时间。

Master Protein

Accessions

Gene Name Annotated

Sequence

Charge m/z RT
蛋白ID号 蛋白基因名 肽段序列 所带电荷数 质荷比 保留时间


2. 目标蛋白质肽段定量结果

该表展示4D-PRM正式实验中目标蛋白质肽段的序列、定量值(相对表达值)等。

PG.Proteinld PG.Geneld EG.Precursorld EG.Qvalue EG.TotalQuantity
蛋白ID号 蛋白基因名 母离子氨基酸序列

及其带电荷数

错误发生率(FDR) 肽段定量值


3. 目标蛋白质定量及组间比较结果

该表展示4D-PRM正式实验中目标蛋白质所检测到的肽段数、在各样本中的相对表达值、各组别的平均表达值及两组间比值(即变化倍数)及显著性p值。

PG.Proteinld PG.Geneld PG.PrecursorCount PG.ProteinDescription PG.NrOfPrecursorsident

ified

蛋白ID号 蛋白基因名 蛋白肽段数 蛋白质功能描述 鉴定到的母离子数目
PG, Quantity Average x Average Y X/Y P Value
蛋白质的强度值

(相对表达值)

蛋白质在X组的

相对表达平均值

蛋白质在Y组的

相对表达平均值

蛋白质在X组的平均值与

Y组的平均值的比值

差异比较的显著性p值

文献案例

一、PRM:联合蛋白质组学,筛选潜在生物标志物

文献1:蛋白质组学筛选区分恶性前和恶性胰腺癌囊性病变的生物标志物


期刊:Journal of Clinical Oncology

影响因子:44.544

发表单位:哥德堡大学

发表时间:2017年11月

胰腺囊性病变是影像学上常见的一种偶尔发现,但多达一半的可能是胰腺癌的前兆。因此,准确地诊断是患者治疗的关键。目前可用的诊断方法不能可靠地识别癌前和恶性胰腺囊性病变。因此,本研究的主要目的是在多个队列中利用定量蛋白质组学发现识别和区分癌前胰腺囊性病变(PCL)与显著高级别发育异常(HGD)/癌症和囊性肿瘤的标志物。最终通过靶向蛋白的PRM检测找到了相关的蛋白标志物:粘蛋白-5AC和粘蛋白-2构成的组合在验证队列中区分恶性前/恶性病变和良性病变的准确率为97%,显著高于传统的癌胚抗原和细胞学检查的结果。粘蛋白-5AC和前列腺干细胞抗原(PSCA)联合识别高级别发育异常/癌症的准确率为96%。该研究将有助于及时进行癌症诊断并及早地进行疾病的干预或预防。



文献2:DIA蛋白质组学+PRM鉴定晚期肺癌化疗响应的生物标志物


期刊:Translational Lung Cancer Research

影响因子:6.496

发表单位:北京大学肿瘤医院

发表时间:2021年2月

培美曲塞/铂类化疗是肺腺癌患者的标准化疗方案,但疗效差异很大。为了发现新的血清生物标志物来预测培美曲塞/铂类化疗的疗效,作者对20例接受培美曲塞/铂类化疗的晚期肺腺癌患者的血清样本进行了DIA蛋白质组学检测。化疗响应良好组(PR)与化疗响应差(PD)组相比共得到23个差异蛋白,其中7个蛋白对于治疗响应预测的ROC AUC值高于0.8。为了进一步验证DIA蛋白质组学结果,作者使用RPM在这20名患者的研究队列和一个新的、包含22名晚期肺腺癌患者(16名PR和6名PD)的队列中检测了16个候选血清生物标志物。PRM验证与DIA蛋白质组学表现出较好的一致性,10种差异蛋白质显示出类似的上调或下调。总体,研究者通过DIA蛋白质组学和PRM验证找到了潜在的、能较好反应晚期肺腺癌治疗响应的蛋白标志物。


二、PRM:蛋白质组学,进行简单的机制研究



文献1:蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学揭示新发强直性脊柱炎患者中异常的免疫调节

期刊:Frontiers in Immunology

影响因子:7.561

发表单位:深圳人民医院

发表时间:2022年3月

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性炎症性疾病,具有较高的发病率和死亡率。本文,研究者对新发AS患者和健康人的外周血单个核细胞(PBMC)的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学进行检测,并通过生信分析揭示了强直性脊柱炎患者存在的免疫调节的异常。随后,研究者对免疫调节相关差异变化蛋白(共19个)进行了PRM验证,验证结果与蛋白质组学结果高度一致,再次确认了免疫调节相关功能的异常。这些蛋白或可作为AS诊断的候选标志物和新的治疗靶点。




文献2:蛋白质组学揭示骨肉瘤细胞对IL-6干预洛铂处理的响应



期刊:Frontiers in Oncology

影响因子:6.244

发表单位:第四军医大学唐都医院

发表时间:2021年3月

洛铂(lobaplatin)是第三代铂类抗肿瘤药物,广泛用于骨肉瘤切除前后的治疗。然而,洛铂耐药将引起治疗失败。研究者发现骨肉瘤细胞在用外源性白细胞介素-6(IL-6)处理后对洛铂变得不敏感,研究者应用蛋白质组学阐明这其中的潜在机制。

研究者对对照组、洛铂治疗组、重组人白细胞介素-6(rhIL6)和洛铂治疗组的骨肉瘤细胞进行了蛋白质组学检测,并通过PRM验证了31个差异蛋白,其中G3BP1、hFXR1p和FUBP显著差异表达。免疫组织染色和免疫荧光染色结果也显示这三个蛋白在洛铂耐药骨肉瘤患者标本中高表达,而在洛铂敏感骨肉瘤患者标本中呈阴性或弱表达。敲除FUBP1显示,在FUBP1沉默的细胞中,洛铂的IC50值显著降低,表明FUBP1缺失可增加骨肉瘤细胞对洛铂的敏感性。该结果揭示了FUBP1在骨肉瘤药物敏感性中的作用以及通过沉默FUBP1增加骨肉瘤洛铂敏感性的潜在治疗价值。




三、PRM:WB/PCR的互补技术,一次验证更多蛋白质

文献1:KIF5A依赖的轴突转运缺陷干扰三甲基氯化锡(TMT)诱导的神经毒性



期刊:Autophagy

影响因子:16.016

发表单位:浙江大学医学院公卫学院

发表时间:2020年3月

三甲基氯化锡(TMT)作为杀菌剂和塑料稳定剂广泛应用于工农业领域,并被普遍认为具有较强的神经毒性,特别是在大脑海马体中。然而,TMT诱导神经毒性的机制尚不清楚。本文,研究者使用蛋白质组学和生信分析,揭示了巨自噬/自噬-溶酶体机制在TMT诱导的神经毒性中的重要作用。TMT通过抑制溶酶体功能,如抑制溶酶体蛋白水解,改变溶酶体pH值,显著损害了自噬通量,从而导致自噬清除缺陷,进而导致神经细胞死亡。在机制上,IPA分析确定了一个下调的分子——KIF5A,是TMT诱导的受损的自噬通量的关键靶点。TMT降低了KIF5A蛋白的表达,破坏了KIF5A与溶酶体之间的相互作用,并损害了溶酶体轴突转运。研究者的结果证明,在TMT诱导的神经毒性中,KIF5A依赖的轴突转运缺陷通过干扰溶酶体功能而导致自噬通量损伤,调控KIF5A可能是一种对抗TMT诱导的神经毒性的治疗方法。

本文中,在研究KIF5A逆转TMT毒性的作用中,研究者使用PRM靶向检测了TMT处理的KIF5A过表达细胞中与自噬相关的蛋白的表达,并通过比较发现KIF5A逆转了TMT处理造成的蛋白变化。




文献2:WDR45通过调控内质网稳态和神经元死亡参与神经退行性病变



期刊:Autophagy

影响因子:16.016

发表单位:华东师范大学生命学院

发表时间:2019年6月

β螺旋桨蛋白相关神经退行性疾病(BPAN)是一类脑组织铁沉积相关的神经退行性疾病。表现为儿童期的运动和认知功能发育迟缓、智力残疾,并一直延续到成年。外显子测序发现了WDR45突变,但WDR45丧失如何导致BPAN的神经变性的机制仍不清楚。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建了WDR45敲除小鼠,以期在该模型基础上研究WDR45基因的致病机理。

为了验证WDR45敲除是否成功,研究者分别用mRNA qRT-PCR和WB检测WDR45的mRNA和蛋白在实验组中的表达缺失。qRT-PCR明确了WDR45的显著缺失,但商业化的抗体无法在对照组和实验组检测到WDR45蛋白的表达,于是研究者利用PRM技术靶向检测了WDR45。PRM结果显示在实验组中,WDR45的两条特异性肽段都显著缺失,明确了WDR45蛋白的缺失。综合mRNA qRT-PCR和蛋白的PRM靶向检测证明了研究者对WDR45敲除的成功。因此,PRM是很好的进行靶向蛋白质检测的技术,研究者可以根据实验的具体情况灵活选择蛋白检测或者验证的技术。


送样建议

1. 样本寄送流程



注意:所有样本均应标明准确的样本编号,同时配有一张样本登记表,写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。


2. 样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。


3. 取样原则

(1)代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义,因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织,正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时,应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。

(2)准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录,并按要求(低温、迅速)采集、制备、贮存、运输,最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

(3)迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素,因此用于蛋白质组研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

(4)低温原则

所取样本离体后,应尽快置于液氮(首选)、干冰或-80℃冰箱中,并保证在实验前始终处于-70℃以下,以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

(5)分装原则

为避免样本冻融,建议收集样本的时候对样本进行分装备份,从而保证数据质量的可靠性,检测结果的准确性。


4. 取样要求

(1)样本量要求

样本大类

样本类型

4D-PRM送样量

细胞类

悬浮/贴壁细胞

≥1×10^6

动物

组织

心,肝,脾,肾,肺叶,血管等

≥15mg

皮肤,软骨,毛发等坚硬组织

≥100mg

体液类

血清、血浆(去高丰度蛋白,抗体亲和柱法)

≥50μl

血清、血浆(富集低丰度蛋白,纳米颗粒材料法)

≥200μl

血清、血浆(不去高丰度)

≥20μl

动物或人乳汁

≥1ml

脑脊液(去高丰度蛋白)

≥5ml

脑脊液(不去高丰度)

≥1ml

关节液、淋巴液、附睾腔液

≥1ml

唾液

≥50μl

泪液

≥150μl

尿液

≥8ml

其余特殊类型样本

细胞上清

≥2.5ml

石蜡样本(FFPE)

15片(切片厚度5-10μm)


(2)本地样本预处理与保存建议

样本大类

样品类型

预处理及保存

细胞类

悬浮细胞

1. 400g-1000g离心10分钟收获细胞,弃上清;

2. 用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次,置于冰上,去上清;

3. 液氮速冻,-80℃保存。

建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解,裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题,我们需要进一步进行蛋白沉淀,这个过程可能会有一点蛋白的损失。

注意:PBS清洗时需要小心,避免细胞的损失!

贴壁细胞

1. 弃掉培养液,并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液;

2. 加入4℃预冷的PBS,平放轻轻摇动1 分钟洗涤细胞,然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液;

3. 将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4℃预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧(动作要快),冰上斜置培养皿,使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清;

4. 液氮速冻,-80℃保存。

建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解,裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题,我们需要进一步进行蛋白沉淀,这个过程可能会有一点蛋白的损失。

注意:PBS清洗时需要小心,避免细胞的损失!

动物组织

样本

心,肝,脾,肾,肺叶,血管,皮肤等

1.首先准备好用于包装样本冷冻保存管,并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号;

2.准确切除所需组织后,立即剔除非研究所需的组织,并将组织分割成小块;

3.用镊子夹住样本,放入液氮中冷却样本;

4.放入准备好的冷冻保存管中,迅速投入液氮冷却,然后转入-80℃冰箱中保存;

5.填写样本登记单,写明临床病因及所处阶段,样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

软骨等坚硬组织

PBS 洗涤,用手术刀将软骨切成0.5cm3 左右的小块。液氮速冻,保存在-80℃。

毛发等坚韧组织

用适量2%SDS,50mM 磷酸钠(pH7.8)缓冲液漂洗样品,去除污染物,干燥,保存在-80℃。

体液类

血清

收集好的全血室温静置两小时,3000g 离心10min,取上清,液氮速冻,-80℃保存。

血浆

收集好的全血加入抗凝剂(可选择肝素或EDTA),室温静止30 分钟,1300g-2000g 离心10min,取上清,液氮速冻,-80℃保存。

动物或人乳汁

收集乳汁,-80℃保存。若要去除样品中的高丰度酪蛋白,需要超速离心除去。

脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液

1000g-2000g 离心5min,(或使用0.22μm 滤膜过滤),取上清,-80℃保存。

唾液

禁食两小时以上,9-12am 取样,1000g-2000g 离心5min,(或使用0.22um 滤膜过滤),取上清,-80℃保存。

泪液

收集样品(可利用capillary micropipette 或Schirmer strip),8000-14000g  4度 离心5min,取上清, -80℃保存。

尿液

5000g 4°C 离心30-60min,取上清, -80℃保存。

其余特殊类型样本

细胞上清

10000g-20000g 离心30-60min,(或使用0.22um 滤膜过滤),取上清,-80℃保存,注意,应为无血清培养基。

石蜡样本(FFPE)

以石蜡块形式保存的样本进行常规切片操作(切片厚度5-10μm),不用固定在玻片上,检查样本无污染后,妥善包装,常温寄送。


5. 样本包装注意事项

(1)在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面,用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。

(2)请勿用纱布、纸张直接包裹样本,而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

(3)请勿用玻璃容器在液氮中保存样本;样本包装中请勿使用透明胶带。

(4)请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内,因为纸张在液氮中是易碎的。

(5)标签纸应该贴于样本袋绳上,请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

(6)请勿在一只样本袋中放过多的样本,以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。

(7)在填写《样本登记单》时应当详细描述(临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段)样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节,以便技术人员确定合理的实验方案。


6. 样本储存注意事项

(1)细胞样本收集好后,立即放入-80℃保存。

(2)组织样本采集后,样本迅速放入进口高质量冻存管中,拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。

(3)组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本,务必注意,不要用Eppendorf管和国产冻存管,因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。


7. 样本运输注意事项

(1)飞机运输干冰上限约为2公斤,超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

(2)干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱,材料用编号后的冻存管存放,用塑料袋包装后埋入干冰中,泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装,以免碰裂。并标明轻取轻放提示,以保证安全运输。

(3)运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。

(4)如委托快递运输,运输过程中应随时跟踪货物的情况,记录货单号,并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。

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