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4D-DIA蛋白组学

产品简介

蛋白质组学技术可分为数据依赖型(Data-dependent acquisition,DDA)策略和数据非依赖采集(Data-independent Acquisition,DIA)策略。相较于DDA在一级质谱中在每个时间窗口采集强较高的有限肽段离子进入二级质谱进行碎裂分析;DIA数据采集策略则是将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,并循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息,但其数据采集策略会使得谱图高度复杂,给数据解析带来极大的挑战。



4D-DIA蛋白质组学同时集合了4D蛋白质组和DIA技术的优势。外加的第四维离子淌度分离,有效降低了谱图复杂度,缓解了传统DIA技术面临的最大问题;同时近乎100%的离子利用率,全面提升了蛋白质鉴定能力、检测灵敏度和数据完整性,具有划时代的重大意义。



应用方向

适用于大规模样本的生物标志物筛选、分子分型研究

项目流程

4D-DIA项目流程包括样本准备、实验室样本制备、建库与上机检测、数据预处理和生信挖掘等5大环节。


技术特点

1. 更高的准确度:4D仪器能有效区分共洗脱肽段/同分异构体肽




2. 更高的鉴定能力:4D-DIA显著提升传统DIA技术的检测能力



3. 更少的数据缺失值:4D-DIA全扫描技术,数据缺失值非常少,更适合大样本检测




4. 更好的定量重复性:4D-DIA定量稳定性好,数据重复性高,相关性在0.9以上,无需进行靶向验证





开yun体育app官方下载优势

1. 丰富的样本处理经验,支持各类科研需求;

2. 严格的质量标准,优秀的技术检测能力,达到国际顶尖实验室水平;



3. 追求极致的报告体验,提供三套差异筛选标准结果,报告解读、数据挖掘视频及中英文方法说明等应有尽有,详情点结果示例;

4.专业的售前售后服务,及时响应客户消息,全力解决客户问题。


结果展示

开yun体育app官方下载一直致力于提供专业的蛋白质组学服务,基于蛋白质组学数据挖掘需求以及对高水平文章的生信分析内容的分析,开yun体育app官方下载蛋白质组学报告提供20多项标准分析,远超行业常规交付标准,助力广大科研用户数据挖掘轻松又高效!



详情可点击往期报道:

蛋白质组学新势力| 开yun体育app官方下载2022版蛋白质组学分析报告重磅发布,打造行业高标准生信分析!

2023新品系列!开yun体育app官方下载蛋白质组学报告再更新,6大亮点助力临床科研更省心、更省力、更高效



1.  多种样本平行性及质量评价维度:从源头上把控数据质量,以提高分析结论的可靠性、可重复性



2. 三套差异筛选标准:让每套数据找到最适合的标准

group

P≤0.05 & FC上下调倍数

上调蛋白质个数(UP)

下调蛋白质个数(DOWN)

总差异蛋白质个数(ALL)

A VS B

1.2

224

184

408

A VS B

1.5

77

63

140

A VS B

2

22

14

36


三套差异筛选结果一览表(示例)


3.  提供关键蛋白质候选列表:让临床科研更轻松、高效。

Pretein ID GeneName FC p-value Regulation
蛋白质的Uniprot ID号 基因名称 差异表达变化伯数 t-test量著性p 值 上调或下调
GO-BP Go-CC GO-MF KEGG GSEA-GO
归属到的显著性富集GO-BP条目(名称&数量) 归属到的显著性富集GO-CC条目(名称&数量) 归属到的显著性富集GO-MF条目(名称&数量) 归属到的显著性富集KEGG条目(名称&数量) 归属到的显著性富集GSEA-GO条目(名称&数量)
GSEA-KEGG PPI degree Transcription factor Kinase Cancer pathway related
归属到的显著性富集GSEA-KEGG条目(名称&数量) 在PPI分析中与其他蛋白连接的节点数 是否属于转录因子 是否属于激酶 是否属于肿瘤通路相关蛋白
Pubmed文献数 PRM预实验评估结果
在Pubmed中检索到的文献数 是否通过PRM预实验评估

关键蛋白质候选列表(表头示例)


4.  多种GO/KEGG富集分析方法:多角度分析,让“烂”的数据也能挖出结果

(1)基于差异蛋白质的传统富集分析方法(Fisher’s Exact Test)





(2)不依赖于差异蛋白质的GO/KEGG富集分析(GSEA分析)





5.  交互式蛋白质互作PPI:支持个性化排版,悬浮显示蛋白质的多项特征信息




6.  蛋白质动态分布范围图:展示蛋白含量高低,高低丰度一清二楚





7.  多组比较提供韦恩分析:展示多比较组的共有和特有差异蛋白质


文献案例


期刊: Nature Communications

影响因子:17.694

发表单位:北京大学医学部、中国疾控中心等

发表时间: 2020年11月


一、研究背景

新冠肺炎的爆发已经成为一种世界性的流行病。这种传染病的发病机制以及它与肺炎的其他驱动因素有何不同尚不清楚。


二、研究结果

1. 新冠肺炎病的尿液蛋白质组分析

研究者对来自健康志愿者(10名),COVID-19患者(14名)和非COVID-19肺炎患者(13名)的尿液样本开展了基于DIA-PASEF方法的定量蛋白质组学分析。在所有37个样品中共鉴定出5991种蛋白质。与健康志愿者和非COVID-19肺炎病例相比,COVID-19感染病例组1986个蛋白质水平发生了显著变化。令人惊讶的是,在新冠肺炎组中鉴定出的下调蛋白比上调蛋白多近10倍。KEGG富集分析揭示了与新冠肺炎感染相关的分子景观,十多条通路发生了显著变化。特别是新冠肺炎对免疫相关途径、TJ途径和代谢途径产生了强烈影响。




2. 免疫系统在新冠肺炎病的早期受到抑制

研究发现大量与免疫反应相关的蛋白质被下调,这表明新冠肺炎病患者的免疫反应受到抑制。新冠肺炎患者中蛋白酪氨酸磷酸酶受体C、瘦素和抗酒石酸酸性磷酸酶5的蛋白水平显著降低。这与COVID-19患者血液检测的低淋巴细胞和血小板计数现象一致。一些补体蛋白表达量下调,表明补体系统的显著损伤。参与FcγR介导的吞噬作用的脾脏酪氨酸蛋白激酶水平在患者中显著降低,表明微球、噬中性粒细胞、自然杀伤细胞和单核细胞的吞噬作用被抑制。据报道,在新冠肺炎病患者从轻度到重度的转变过程中,血清中载脂蛋白A-I水平降低。在此项工作中,观察到新冠肺炎患者的载脂蛋白A-IV(APOA4)和载脂蛋白E表达下调,可能与巨噬细胞功能有关。此外,观察到与趋化因子信号通路相关的蛋白水平下降,说明单核细胞激活、B细胞迁移和T细胞介导的免疫应答下降。

急性缺氧和ARDS是新冠肺炎患者高病死率的两个主要原因。以前的研究表明,肺泡上皮屏障通透性的显著增加会导致肺泡水肿和渗出液形成,并且是导致ARDS低氧血症的主要因素之一。肺上皮的屏障功能取决于一组TJ异构复合物,它们封闭了相邻上皮细胞之间的界面。TJs也存在于其他器官的上皮细胞之间,如肠、肾和脑。TJ复合物的破坏是病毒感染过程中上皮屏障破坏的主要原因。我们发现,在新冠肺炎患者中,许多参与TJ形成和细胞-细胞粘附连接的蛋白显著下调,表明病毒可能在病毒入侵期间改变细胞间TJ形成和上皮形态发生。这反过来可能会破坏保护下层组织的物理屏障。

在新冠肺炎患者尿液中显著上调或下调的蛋白质中,金属硫蛋白-1G、脂蛋白脂酶、β2M、PRKACA、FOLR2和APOA4与健康对照组和非COVID-19肺炎病例相比均显示出显著变化。这些蛋白质是鉴别诊断新冠肺炎病的潜在生物标志物,可以使诊断更加精确。值得注意的是,6种蛋白质中有4种与免疫反应和TJs相关,是新冠肺炎患者中鉴定的两种特征性途径。





3. 重症新冠肺炎病患者的免疫反应被激活

据报道,细胞因子风暴发生在新冠肺炎病患者的晚期。为了理解新冠肺炎病的发病机理,有必要找出在疾病发展过程中转变是如何发生的。为了进一步研究这一点,我们将新冠肺炎患者细分为9个中度病例和5个重度病例。主成分分析显示中度和重度新冠肺炎患者样本分离良好。GO富集分析表明,大多数上调蛋白参与补体和凝血级联反应、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和血小板活化。详细观察中度和重度亚组,我们发现有趣的是,在疾病的晚期出现了一定程度的活化免疫反应,而免疫抑制效应仍保持在早期。这些结果表明,在疾病的晚期,免疫反应被激活,这与重症和危重期患者出现过度免疫反应和细胞因子风暴一致。我们的研究还确定了两种特征蛋白,免疫球蛋白λ变量3-25和延伸因子1-alpha 1,它们可能表明COVID-19疾病的两个阶段的进展。




三、研究总结

该工作采用了基于质谱的定量蛋白质组方法,分析了COVID-19感染病例、健康捐赠者和非COVID-19肺炎病例的尿液样本。揭示了感染初期免疫抑制和COVID-19患者紧密连接受损的情况。与早期相比,在感染的后期,免疫反应在一定程度上被激活。这些研究提供了与COVID-19疾病相关的分子变化图谱,并为可能发生的两期发病机制提供了线索。


送样建议

1. 样本寄送流程



注意:所有样本均应标明准确的样本编号,同时配有一张样本登记表,写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。


2. 样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。


3. 取样原则

(1)代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义,因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织,正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时,应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。

(2)准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录,并按要求(低温、迅速)采集、制备、贮存、运输,最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

(3)迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素,因此用于蛋白质组研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

(4)低温原则

所取样本离体后,应尽快置于液氮(首选)、干冰或-80℃冰箱中,并保证在实验前始终处于-70℃以下,以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

(5)分装原则

为避免样本冻融,建议收集样本的时候对样本进行分装备份,从而保证数据质量的可靠性,检测结果的准确性。


4. 取样要求

(1)样本量要求

样本大类

样本类型

4D-DIA送样量

细胞类

悬浮/贴壁细胞

≥1×10^6

动物

组织

心,肝,脾,肾,肺叶,血管等

≥15mg

皮肤,软骨,毛发等坚硬组织

≥100mg

体液类

血清、血浆(去高丰度蛋白,抗体亲和柱法)

≥50μl

血清、血浆(富集低丰度蛋白,纳米颗粒材料法)

≥200μl

血清、血浆(不去高丰度)

≥20μl

动物或人乳汁

≥1ml

脑脊液(去高丰度蛋白)

≥5ml

脑脊液(不去高丰度)

≥1ml

关节液、淋巴液、附睾腔液

≥1ml

唾液

≥50μl

泪液

≥150μl

尿液

≥8ml

其余特殊类型样本

细胞上清

≥2.5ml

石蜡样本(FFPE)

15片(切片厚度5-10μm)


(2)本地样本预处理与保存建议

样本大类

样品类型

预处理及保存

细胞类

悬浮细胞

1. 400g-1000g离心10分钟收获细胞,弃上清;

2. 用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次,置于冰上,去上清;

3. 液氮速冻,-80℃保存。

建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解,裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题,我们需要进一步进行蛋白沉淀,这个过程可能会有一点蛋白的损失。

注意:PBS清洗时需要小心,避免细胞的损失!

贴壁细胞

1. 弃掉培养液,并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液;

2. 加入4℃预冷的PBS,平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞,然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液;

3. 将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4℃预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧(动作要快),冰上斜置培养皿,使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清;

4. 液氮速冻,-80℃保存。

建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解,裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题,我们需要进一步进行蛋白沉淀,这个过程可能会有一点蛋白的损失。

注意:PBS清洗时需要小心,避免细胞的损失!

动物组织

样本

心,肝,脾,肾,肺叶,血管,皮肤等

1.首先准备好用于包装样本冷冻保存管,并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号;

2.准确切除所需组织后,立即剔除非研究所需的组织,并将组织分割成小块;

3.用镊子夹住样本,放入液氮中冷却样本;

4.放入准备好的冷冻保存管中,迅速投入液氮冷却,然后转入-80℃冰箱中保存;

5.填写样本登记单,写明临床病因及所处阶段,样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

软骨等坚硬组织

PBS洗涤,用手术刀将软骨切成0.5cm3 左右的小块。液氮速冻,保存在-80℃。

毛发等坚韧组织

用适量2%SDS,50mM磷酸钠(pH7.8)缓冲液漂洗样品,去除污染物,干燥,保存在-80℃。

体液类

血清

收集好的全血室温静置两小时,3000g离心10min,取上清,液氮速冻,-80℃保存。

血浆

收集好的全血加入抗凝剂(可选择肝素或EDTA),室温静止30分钟,1300g-2000g离心10min,取上清,液氮速冻,-80℃保存。

动物或人乳汁

收集乳汁,-80℃保存。若要去除样品中的高丰度酪蛋白,需要超速离心除去。

脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液

1000g-2000g离心5min,(或使用0.22μm滤膜过滤),取上清,-80℃保存。

唾液

禁食两小时以上,9-12am取样,1000g-2000g离心5min,(或使用0.22um滤膜过滤),取上清,-80℃保存。

泪液

收集样品(可利用capillary micropipette或Schirmer strip),8000-14000g  4度 离心5min,取上清,-80℃保存。

尿液

5000g 4°C离心30-60min,取上清,-80℃保存。

其余特殊类型样本

细胞上清

10000g-20000g离心30-60min,(或使用0.22um滤膜过滤),取上清,-80℃保存,注意,应为无血清培养基。

石蜡样本(FFPE)

以石蜡块形式保存的样本进行常规切片操作(切片厚度5-10μm),不用固定在玻片上,检查样本无污染后,妥善包装,常温寄送。


5. 样本包装注意事项

(1)在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面,用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。

(2)请勿用纱布、纸张直接包裹样本,而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

(3)请勿用玻璃容器在液氮中保存样本;样本包装中请勿使用透明胶带。

(4)请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内,因为纸张在液氮中是易碎的。

(5)标签纸应该贴于样本袋绳上,请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

(6)请勿在一只样本袋中放过多的样本,以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。

(7)在填写《样本登记单》时应当详细描述(临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段)样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节,以便技术人员确定合理的实验方案。


6. 样本储存注意事项

(1)细胞样本收集好后,立即放入-80℃保存。

(2)组织样本采集后,样本迅速放入进口高质量冻存管中,拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。

(3)组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本,务必注意,不要用Eppendorf管和国产冻存管,因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。


7. 样本运输注意事项

(1)飞机运输干冰上限约为2公斤,超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

(2)干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱,材料用编号后的冻存管存放,用塑料袋包装后埋入干冰中,泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装,以免碰裂。并标明轻取轻放提示,以保证安全运输。

(3)运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。

(4)如委托快递运输,运输过程中应随时跟踪货物的情况,记录货单号,并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。

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