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Shotgun蛋白质定性检测

产品介绍

Shotgun(鸟枪法)是鉴定蛋白质混合物中蛋白质组成的常见方法。Shotgun的原理是蛋白在经过蛋白胰酶酶解后形成肽段,然后通过高效液相色谱分离,并进入质谱检测。通过二级质谱中肽段碎裂片段的信号分布与理论肽段碎裂片段的比对,实现对肽段的定性(氨基酸序列认定),最终实现对蛋白质的定性鉴定。

应用方向

蛋白胶点胶条鉴定、相互作用蛋白鉴定、全蛋白质组鉴定。

项目流程

Shotgun项目流程包括样本准备、实验室样本制备(含抽提蛋白和肽段酶解)、上机检测、数据处理4大环节。

技术特点

1. 适合各类样本的蛋白质鉴定:尤其适合对蛋白电泳考染胶条或银染胶条(银染试剂需与质谱兼容)、IP/CO-IP/Pull-Down洗脱液等样本中蛋白质的鉴定;

2. 样本要求低:由于仅进行蛋白质定性鉴定而不进行定量,因此微量样本即可满足实验要求。

开yun体育app官方下载优势

1. 丰富的样本处理经验,支持各类科研需求;

2. 严格的质量标准,优秀的技术检测能力;

3. 专业的售前售后服务,及时响应客户消息,全力解决客户问题。

结果展示

蛋白质鉴定信息表

Accession Gene Name Description Coverage [%] # Peptides
蛋白质ID号 蛋白质的基因名 蛋白质在数据库中的描述 肽段覆盖率 肽段数
# PSMs # Unique Peptides # AAs MW [kDa] calc. pl
匹配到肽段的质谱图谱总数 唯一肽段数 蛋白质的氨基酸总数目 蛋白质的理论分子量 蛋白质的理论等电点


肽段鉴定信息表

Sequence Modifications Qvality PEP Qvality q-value #PSMs Master Protein Accessions
肽段氨基酸序列 该肽段上存在的固定修饰 后验错误概率 最小的错误发生率 匹配到肽段的质谱图谱总数 蛋白质ID号
# Missed Cleavages Theo. MH+ [Da] Charge (by Search Engine): Mascot DeltaM [ppm] (by Search Engine): Mascot RT [min] (by Search Engine): Mascot lons Score (by Search Engine): Mascot
胰酶漏切位点数量 带一个电荷(质子化)的肽段理论分子量 肽段电荷数 肽段理论分子量和实验测得分子量的差异 保留时间 搜库软件给出的肽段得分


肽段二级质谱图(需指定肽段或蛋白)

肽段序列:TGDLGDINAEQLPGR



文献案例

期刊: Analytical Chemistry

影响因子: 8.008

发表单位:郑州大学

发表时间: 2022年12月


研究背景

在全球,食道癌是癌症相关死亡的第六大常见原因,对人类健康构成巨大威胁。食管癌有食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌两大亚型,ESCC约占所有食管癌的90%。大多数被诊断为食管癌的患者处于晚期转移,导致预后不良,死亡率高。在临床实践中,目前食管癌的治疗方法主要局限于常规方法,包括手术切除、化疗和放疗。目前,食道癌明显缺乏分子靶向治疗。因此,迫切需要开发用于食管癌早期诊断和治疗的识别分子和分子靶点。


研究结果

1. 利用Cell-SELEX技术筛选得到与靶细胞高亲和力结合的核酸适配体

A2、A3、A4核酸适配体与靶细胞结合的解离常数均为纳摩尔级别,三条核酸适配体均能够结合在靶细胞的细胞膜上,核酸适配体A2能够特异性识别病人食管鳞癌组织。




补充知识SELEX技术即指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。Cell-SELEX技术是在SELEX技术基础上,获取能与特定靶细胞结合的适配体的方法。


2. 核酸适配体A2与靶细胞结合的分子靶标为整合素β1(Integrin β1)

利用流式细胞术初步验证出核酸适配体A2与靶细胞结合的靶标为蛋白质,利用Pull-down实验及开yun体育app官方下载提供的质谱技术(Shotgun)、基因敲低实验进一步验证出A2结合靶标为Integrin β1。此外,通过分子对接技术准确地预测出A2与Integrin β1的具体结合位点。



3. 设计A2连接的DNA纳米结构,实现化疗药物Dox的靶向递送

利用HCR(杂交链式反应)原理,设计出A2连接的DNA纳米结构,该纳米结构能够负载自身浓度100倍的Dox,并将其靶向递送至靶肿瘤细胞中,降低化疗药物的毒副作用。



研究结论

1. 通过Cell-SELEX,筛选得到与低分化食管鳞癌KYSE410细胞高亲和力高特异性结合的核酸适配体,其中核酸适配体A2能够特异性成像患者食管鳞癌组织,有望作为一种特异性成像探针应用于食管鳞癌的诊断;

2. 经鉴定核酸适配体A2与靶细胞结合的主靶标为整合素β1,具备作为食管鳞癌标志物和治疗靶点的潜力;

3. 以核酸适配体A2为靶向分子设计并构建了A2-NA纳米结构,该纳米结构能够负载高浓度的Dox并将其特异性递送至靶细胞,实现肿瘤的靶向治疗。


开yun体育app官方下载助力

本研究使用质谱检测(Shotgun)核酸适配体A2结合的目标蛋白,由开yun体育app官方下载提供技术服务。



送样建议

1.样本寄送流程





注意:所有样本均应标明准确的样本编号,同时配有一张样本登记表,写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。


2.样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库;


3.取样原则

(1)代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义,因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织,正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时,应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。

(2)准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录,并按要求(低温、迅速)采集、制备、贮存、运输,最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

(3)迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素,因此用于蛋白质组研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

(4)低温原则

所取样本离体后,应尽快置于液氮(首选)、干冰或-80℃冰箱中,并保证在实验前始终处于-70℃以下,以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

(5)分装原则

为避免样本冻融,建议收集样本的时候对样本进行分装备份,从而保证数据质量的可靠性,检测结果的准确性。



4.取样要求及保存建议

样本大类

样本类型

Shotgun送样量

本地样本预处理及保存建议

IP/Co-IP类

IP 或 CO-IP 实验中漂洗后的,含有磁珠(Magnetic Beads)或琼脂糖珠(Agarose Beads)的样

微量样本即可做。一般30-50ul,如已知蛋白浓度低,可增加送样量。

-80℃保存,干冰寄送。方案和送样单中需备注样本含磁珠或琼脂糖珠。

IP 或 CO-IP 实验最终的洗脱液(不需要变性)

微量样本即可做。一般30-50ul,如已知蛋白浓度低,可增加送样量。

-80℃保存,干冰寄送。方案和送样单中需备注样

本为IP 或 CO-IP 洗脱液。

考染胶条

目标蛋白条带位置的胶条或整个泳道的胶条。要求条带清晰,肉眼可辨。

切取胶条后放入

干净的管子中,可加入少量超纯水,防止胶条变干,密封后冰袋寄送即可。

银染胶条

(要求银染试剂与质谱兼容)

目标蛋白条带位置的胶条或整个泳道的胶条。要求条带清晰,肉眼可辨。

切取胶条后放入

干净的管子中,可加入少量超纯水,防止胶条变干,密封后冰袋寄送即可。

Pull-Down类

RNA或DNA Pull-Down实验最终洗脱液

微量样本即可做。一般30-50ul,如已知蛋白浓度低,可增加送样量。

-80℃保存,干冰寄送。方案和送样单中需备注样本为RNA或 DNA Pull-Down洗脱液。


5.样本包装注意事项

(1)在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面,用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。

(2)请勿用纱布、纸张直接包裹样本,而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

(3)请勿用玻璃容器在液氮中保存样本;样本包装中请勿使用透明胶带。

(4)请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内,因为纸张在液氮中是易碎的。

(5)标签纸应该贴于样本袋绳上,请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

(6)请勿在一只样本袋中放过多的样本,以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。

(7)在填写《样本登记单》时应当详细描述(临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段)样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节,以便技术人员确定合理的实验方案。


6.样本储存注意事项

短期保存(1周内)可置于4℃;1~2个月内的保存,可置于-20℃;若需长期保存,需置于-80℃环境。


7.样本运输注意事项

(1)飞机运输干冰上限约为2公斤,超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

(2)干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱,材料用编号后的冻存管存放,用塑料袋包装后埋入干冰中,泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装,以免碰裂。并标明轻取轻放提示,以保证安全运输。

(3)运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。

(4)如委托快递运输,运输过程中应随时跟踪货物的情况,记录货单号,并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。

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